Xây dựng cơ sở dữ liệu để phân biệt các loại sâm bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 574 XÂY DỰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU ĐỂ PHÂN BIỆT CÁC LOẠI SÂM BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG VÀ SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Hoàng Hải Anh*, Nguyễn Minh Cang*, Nguyễn Minh Đức* TÓM TẮT Mục tiêu: Phân biệt các loại sâm thuộc chi Panax gồm Nhân sâm, Tam thất, Sâm Mỹ và Sâm Việt Nam dựa vào sắc ký lớp mỏng (SKLM) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Phương pháp: So sánh sự khác nhau trong thành phần saponin chính của các dược liệu nghiên cứu bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng hiệu năng cao. Kết quả: Có sự khác biệt trong thành phần các saponin chính của các loại sâm khi tiến hành SKLM và HPLC cả về mặt định tính và định lượng. Từ đó có cơ sở để phân biệt các dược liệu trên: Sâm Việt Nam phân biệt với các dược liệu Panax khác do có chứa M-R2; Tam thất phân biệt với các dược liệu Panax khác do có chứa nhiều N-R1 (nhiều hơn Sâm Việt Nam), nhưng không chứa MR2; Nhân sâm và Sâm Mỹ có thành phần saponin khá giống nhau, khác nhau chủ yếu ở thành phần các saponin hàm lượng thấp. Kết luận: Bằng phương pháp SKLM và HPLC có thể phân biệt được một số loại sâm thuộc chi Panax một cách nhanh chóng và chính xác. Từ khóa: Nhân Sâm, Tam thất, Sâm Mỹ, Sâm Việt Nam, Sắc ký lớp mỏng, Sắc ký lỏng hiệu năng cao. ABSTRACT STUDY ON TLC AND HPLC DATA FOR PANAX SPP. DIFFERENTIATION Hoang Hai Anh, Nguyen Minh Cang, Nguyen Minh Duc * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 574 - 578 Objectives: To distinguish Panax ginseng, Panax notoginseng, Panax quinquefolium and Panax vietnamensis by Thin Layer Chromatography (TLC) and High Performance Liquid Chromatography (HPLC). Methods: Analysis of the difference in the saponin composition of Panax ginseng, Panax notoginseng, Panax quinquefolium and Panax vietnamensis by TLC and HPLC. Results: There are differences in the saponin composition of Panax ginseng, Panax notoginseng, Panax quinquefolium, Panax vietnamensis and Panax vietnamensis. Panax vietnamensis is distinct from the others because it contains the major saponin M-R2; Panax notoginseng differs from the others due the major saponin N- R1 in high contents; the saponin composition of Panax ginseng and Panax quinquefolium are different in the minor saponins. Conclusions: Panax ginseng, Panax notoginseng, Panax quinquefolium and Panax vietnamensis can be differentiated by using the TLC and HPLC. Keywords: Panax ginseng, Panax notoginseng, Panax quinquefolium, Panax vietnamensis, TLC, HPLC. ĐẶT VẤN ĐỀ Các loại sâm, gồm các loài thuộc chi Panax là những dược liệu kinh điển và nổi tiếng của y học cổ truyền Đông phương, được sử dụng nhiều trong việc bảo vệ, chăm sóc sức khỏe và điều trị bệnh(4). Ngày nay, các loại Sâm không những được sử dụng ở dạng kinh điển mà còn được bào chế dưới dạng tân dược. Sâm Triều tiên (P. ginseng CA. Mayer), Tam thất (P. *Khoa Dược – Đại Học Y Dược TPHCM Tác giả liên lạc: GS. TS. Nguyễn Minh Đức ĐT: 0908989865 Email: ducng@hcm.vn.vnn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 575 notoginseng (Burk.) F.H. Chen), Sâm Mỹ (P. quinquefolium L.) và Sâm Việt Nam (P. vietnamensis Ha et Grushv.) là các loại sâm có giá trị kinh tế cao và phổ biến nhất. Các nguyên liệu và các chế phẩm từ các loài sâm xâm nhập vào thị trường nước ta từ rất nhiều nguồn như: Trung Quốc, Hàn Quốc, các nước châu Âu, chính thức cũng như không chính thức, có thành phần và hàm lượng của saponin, một hoạt chất quan trọng của các mẫu dược liệu Panax thay đổi rất nhiều. Đặc biệt, thị trường dược liệu nước ta hiện nay đang tràn ngập các loại sâm không rõ nguồn gốc gây ra nhiều khó khăn cho sử dụng các dược liệu Panax này.Vì những lý do trên, việc xác định và phân biệt rõ ràng các dược liệu Panax là hết sức cần thiết và thực tế. Đề tài này nhằm nghiên cứu phân biệt Sâm Triều tiên, Tam thất, Sâm Mỹ và Sâm Việt Nam bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM) và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)(1,3). NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Nguyên liệu Cao khô Nhân sâm, cao khô Tam thất, rễ củ Sâm Mỹ, rễ củ Sâm Việt Nam được lấy mẫu, thu mua từ các nguồn tin cậy. Các mẫu sâm được lưu mẫu tại Ban NCKH-TV Khoa Dược Các saponin chuẩn G-Rb1, G-Rg1, G-Rd, G- Re, N-R1, M-R2 do Ban NCKH-TV sản xuất theo TCCS từ các nghiên cứu công trình trước đây với độ tinh khiết sắc ký > 97%. Phương pháp nghiên cứu Chiết xuất saponin Các mẫu sâm được chiết kiệt hoạt chất bằng thiết bị Soxhlet với dung môi chiết là methanol. Dịch chiết được đem bốc hơi dung môi để thu cắn MeOH. Tinh chế saponin Quá trình tinh chế được thực hiện bằng phương pháp rửa giải qua cột Diaion HP-20 với các dung môi là nước, MeOH, và CHCl3. Gom dịch chiết MeOH, bốc hơi, thu được cắn saponin toàn phần tinh chế. Định tính bằng SKLM Điều kiện sắc ký Bản mỏng tráng sẵn silicagel F254. Dung dịch sắc ký: các chất chuẩn G-Rb1, G- Rg1, G-Rd, G-Re, N-R1, M-R2 và các saponin toàn phần pha trong MeOH. Hệ dung môi: CHCl3-MeOH-H2O (65:35:10, lớp dưới). Thuốc thử hiện màu: H2SO4 20%/EtOH 50%, sấy 105oC đến khi hiện màu. Phân tích thành phần các mẫu dược liệu Panax bằng HPLC Chuẩn bị dung dịch chuẩn Cân chính xác một lượng chất chuẩn mỗi loại G-Rb1, G-Rg1, G-Rd, G-Re, N-R1 hòa tan trong một lượng chính xác methanol, riêng M- R2 hòa tan trong pha động sắc ký. Pha dung dịch thử Cân chính xác gần đúng một lượng cắn saponin của các mẫu sâm, hòa tan trong một lượng chính xác methanol. Lọc qua lọc 0,45 µm, dùng dung dịch này tiến hành phân tích trên HPLC. Điều kiện sắc ký - Máy LC-10 AD – Shimadzu, Nhật Bản, cột Supelcosil RP-18 (150 x 4,6 mm, 5,0 µm) kèm theo cột bảo vệ Supelguard (20 x 4,6 mm) - Detector: photodiode array (SPD-M10A VP – Shimadzu, Nhật Bản) đặt ở bước sóng 203 nm đối với hệ dung môi (i) và (ii); RI đối với hệ dung môi (iii) để phát hiện M-R2. - Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút. Tiến hành HPLC với 3 hệ dung môi: (i) CH3CN-H2O (30: 70); (ii) CH3CN-H2O (20: 80); và (iii) CH3CN-H2O (24: 76). Hệ dung môi (iii) chỉ áp dụng để phân tích và xác định M-R2 trong Sâm Việt Nam. Xác định các đỉnh dựa vào thời gian lưu so với đỉnh các saponin chuẩn chạy trong cùng điều kiện. Xác định hàm lượng của từng thành phần các saponin chính trong dung dịch thử dựa vào các phương trình đường chuẩn. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 576 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Kết quả phân tích bằng SKLM Hình 1. Sắc đồ SKLM saponin các mẫu sâm so sánh với các chất chuẩn NS: Nhân sâm; TT: Tam thất; SM: Sâm Mỹ; SVN: Sâm Việt Nam Bảng 1. Kết quả SKLM saponin các mẫu sâm Rf Nhân Sâm Sâm Mỹ Tam thất Sâm Việt Nam G-Rb1 0,22 x x x x G-Re 0,30 x x x x N-R1 0,32 o o x x G-Rd 0,35 x x x x G-Rg1 0,44 x x x x M-R2 4,48 o o o x x: có xuất hiện vết; o: không xuất hiện vết. Các mẫu sâm khảo sát cho các vết sắc ký đặc trưng của mỗi loại, phù hợp về màu sắc cũng như kích thước vết, có giá trị Rf bằng với Rf của vết chuẩn tương ứng trên bản mỏng, thể hiện trong Hình 1 và Bảng 1. Nhận xét Trong các mẫu khảo sát, chỉ có Sâm Việt Nam có M-R2. N-R1 chỉ quan sát được trên sắc ký đồ Tam thất và Sâm Việt Nam. Kết quả phân tích bằng HPLC Kết quả định tính Hệ dung môi (i): CH3CN-H2O (30: 70) Hình 2. Sắc ký đồ HPLC của Sâm Việt Nam với hệ dung môi CH3CN-H2O (30:70) (Detector PDA; thời gian lưu Rt của G-Rb1 và G-Rd lần lượt là 20,3 và 48,4 phút) Bảng 2. Kết quả HPLC phát hiện G-Rb1 và G-Rd Thời gian lưu (phút) Mẫu G-Rb1 G-Rd Chất chuẩn 20,1 48,2 Nhân Sâm 20,4 48,5 Sâm Mỹ 20,5 48,2 Tam thất 20,2 48,1 Sâm Việt Nam 20,3 48,4 Nhận xét: 4 mẫu sâm khảo sát đều chứa G- Rb1 và G-Rd. Hệ dung môi (ii): CH3CN-H2O (20: 80) Hình 3. Sắc ký đồ HPLC của Sâm Việt Nam với hệ dung môi CH3CN-H2O (20:80) (Dtector PDA; thời gian lưu Rt của G-Rg1 và G-Re lần lượt là 30,5 và 33,1 phút) Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 577 Bảng 3. Kết quả HPLC phát hiện G-Rg1 và G-Re Thời gian lưu (phút) Mẫu G-Rg1 G-Re Chất chuẩn 30,0 33,0 Nhân Sâm 30,0 32,9 Sâm Mỹ 30,0 33,0 Tam thất 30,1 33,1 Sâm Việt Nam 30,5 33,1 Nhận xét: 4 mẫu sâm khảo sát đều chứa G- Rb1 và G-Re. Bảng 4. Thời gian lưu của N-R1 Mẫu Thời gian lưu (phút) Chuẩn NR1 22,3 Tam thất 22,4 Sâm Việt Nam 22,8 Nhận xét: Chỉ phát hiện được N-R1 trong Tam thất và Sâm Việt Nam Hệ dung môi (iii): CH3CN-H2O (24: 76) Hình 4. Sắc ký đồ HPLC của Sâm Việt Nam với hệ dung môi CH3CN-H2O (24:76) (Detector RI; thời gian lưu Rt của M-R2 là 15,0 phút) Bảng 5. Thời gian lưu của M-R2 Mẫu Thời gian lưu (phút) Chuẩn M-R2 15,0 Sâm Việt Nam 15,0 Nhận xét: Chỉ phát hiện được M-R2 trong Sâm Việt Nam. Qua kết quả phân tích cho thấy, với 3 hệ dung môi cùng điều kiện sắc ký phù hợp, các mẫu sâm đều cho các đỉnh đặc trưng của mỗi loài, các đỉnh này có thời gian lưu phù hợp với thời gian lưu của chất chuẩn tương ứng. Dựa vào sự khác nhau trong sắc ký đồ của mỗi loại sâm có thể phân biệt được chúng một cách rõ ràng: - Sâm Việt Nam cho đỉnh của M-R2 đặc trưng trên sắc ký đồ khi tiến hành HPLC với detector RI, trong khi các mẫu sâm khác khác không có. - Tam thất cho đỉnh N-R1 đặc trưng trong khi Nhân Sâm và Sâm Mỹ không có. - Nhân Sâm và Sâm Mỹ cho các đỉnh đặc trưng khá giống nhau, nhưng có sự khác nhau về cường độ đỉnh. Kết quả định lượng Bảng 6. Kết quả định lượng các saponin chính trong các dược liệu Panax khảo sát Hàm lượng saponin chính (%) Mẫu G-Rb1 G-Rg1 G-Rd G-Re N-R1 M-R2 Tổng cộng Nhân Sâm 0,27 0,11 0,06 0,07 o o 0,51 Tam thất 3,14 2,06 0,52 0,26 1,03 o 6,53 Sâm Mỹ 1,85 0,11 0,57 0,80 o o 3,34 Sâm VN 2,51 2,57 1,22 0,16 0,53 5,97 12,96 o: không phát hiện pic Kết quả phân tích cho thấy: - Nhân Sâm có chứa các ginsenosid đặc trưng G-Rb1, G-Rg1, G-Rd, G-Re, trong đó G-Rb1 và G-Rg1 chiếm tỷ lệ cao trong thành phần saponin. Tuy nhiên, tổng hàm lượng ginsenosid chính thấp (0,51%), có thể do chất lượng mẫu sâm khảo sát. Không phát hiện được N-R1 và M-R2 trong mẫu Nhân sâm khảo sát. - Tam thất có chứa các saponin đặc trưng G- Rb1, G-Rg1, G-Rd, G-Re, N-R1, trong đó G-Rb1, G-Rg1 và N-R1 chiếm tỷ lệ cao trong thành phần saponin. N-R1 là saponin đặc trưng của Tam thất so với các dược liệu Panax khác. N-R1 cũng phát hiện trong Sâm Việt Nam tỷ lệ khá cao, nhưng có thể phân biệt với Tam thất vì Tam thất Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 578 không chứa M-R2. Tổng hàm lượng saponin chính khá cao (6,53%). - Sâm Mỹ có chứa các ginsenosid đặc trưng G-Rb1, G-Rg1, G-Rd, G-Re với tỷ lệ cao trong thành phần saponin. Đặc biệt, Sâm Mỹ có tỷ lệ G-Re cao hơn hẳn các mẫu sâm khác. - Sâm Việt Nam có chứa các saponin đặc trưng G-Rb1, G-Rg1, G-Rd, G-Re, N-R1, M-R2 với tỷ lệ cao trong thành phần saponin. Đặc biệt, M- R2 là saponin đặc trưng của Sâm Việt Nam, không có trong các mẫu sâm đã khảo sát khác. Tổng hàm lượng saponin chính trong Sâm Việt Nam cao nhất trong các mẫu sâm khảo sát (~ 13%), trong đó hàm lượng M-R2 chiếm hơn phân nửa (~ 7%), phù hợp với các công trình nghiên cứu trước đây(1). KẾT LUẬN Phương pháp SKLM và HPLC giúp phân biệt được các mẫu sâm có giá trị và phổ biến gồm Sâm Triều tiên, Tam thất, Sâm Mỹ và Sâm Việt Nam. Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở dữ liệu giúp phân biệt các loài sâm nói trên và các chế phẩm của chúng. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. N. M. Duc, N. T. Nham, R. Kasai, A. Ito, K. Yamasaki and O. Tanaka (1993), Saponins from Vietnamese ginseng, Panax vietnamensis Ha et Grushv., Chem. Pharm. Bull., 41, 2010. 2. Nguyễn Minh Đức (2006), Sắc ký lỏng hiệu năng cao và một số ứng dụng vào nghiên cứu, kiểm nghiệm dược phẩm, dược liệu và hợp chất tự nhiên, NXB Y học, Chi nhánh Tp. HCM, tr.49-126, tr.218-232. 3. Nguyen Minh Duc, Nguyen Minh Cang, Nguyen Duc Dieu Trang (2001), “Quantitative determination of major saponin contents of cultivated vietnamese ginseng – Panax vietnamensis Ha et Grushv.-Araliaceae- by HPLC”, Proceedings of Pharma Indochina II,20-23 November, 2001, Hanoi, Vietnam, 247-251. 4. Viện Dược liệu (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Tập II, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr.446-455, tr.704-710, tr.775-779.