Xây dựng quy trình định lượng apigenin trong dược liệu Bán chi liên (Scutellaria barbata D.Don) bằng phương pháp điện di mao quản (CE)

Mục tiêu: Xây dựng quy trình định lượng apigenin trong dược liệu Bán chi liên bằng phương pháp điện di mao quản CE. Đối tượng và phương pháp: Đối tượng nghiên cứu là apigenin có trong dược liệu Bán chi liên. Nghiên cứu được thực hiện trên 5 mẫu Bán chi liên thu mua tại Hà Nội, Nghệ An, Bình Định, Đắc Lắc và Thành phố Hồ Chí Minh. Tiến hành khảo sát các thông số cho quy trình định lượng. Từ đó, xây dựng và thẩm định quy trình định lượng apigenin và áp dụng quy trình này để xác định hàm lượng apigenin trong các mẫu thu thập được. Kết quả: Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng apigenin bằng phương pháp điện di mao quản với các thông số: Bước sóng phát hiện268 nm, Dung dịch đệm borat kiềm pH = 8,8, nồng độ đệm 40 mM, điện thế 15 kV, thời gian tiêm mẫu 2 s, nhiệt độ cột mao quản 25 0C, thời gian điện di 15 phút. Quy trình định lượng đạt tính đặc hiệu, tính phù hợp của hệ thống với RSD của mẫu chuẩn và mẫu thử sau 6 lần tiêm mẫu lần lượt là 3,11% và 2,96%, khoảng tuyến tính của apigenin ở nồng độ 20 – 150 μg/ml (R2 = 0,9995), độ lặp lại của phương pháp với RSD = 3,71%, độ đúng với tỷ lệ phục hồi cao. Sử dụng quy trình đã xây dựng xác định hàm lượng apigenin trong 5 mẫu dược liệu được thu mua tại Hà Nội, Nghệ An, Bình Định, Đắc Lắc và Thành phố Hồ Chí Minh thu được kết quả lần lượt là 1,82 mg/g, 0,60 mg/g, 2,74 mg/g, 3,07 mg/g, 2,85 mg/g. Kết luận Hàm lượng apigenin trong các mẫu Bán chi liên khá cao khoảng từ 1,80 – 3,10 mg/g, trong đó đặc biệt thấp ở mẫu Nghệ An (chỉ khoảng 0,60 mg/g).

pdf6 trang | Chia sẻ: thuyduongbt11 | Ngày: 13/06/2022 | Lượt xem: 200 | Lượt tải: 0download
Bạn đang xem nội dung tài liệu Xây dựng quy trình định lượng apigenin trong dược liệu Bán chi liên (Scutellaria barbata D.Don) bằng phương pháp điện di mao quản (CE), để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 144 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG APIGENIN TRONG DƯỢC LIỆU BÁN CHI LIÊN (SCUTELLARIA BARBATA D.DON) BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN (CE) Ngô Thị Thanh Diệp*, Nguyễn Thị Huyền Thương* TÓM TẮT Mục tiêu: Xây dựng quy trình định lượng apigenin trong dược liệu Bán chi liên bằng phương pháp điện di mao quản CE. Đối tượng và phương pháp: Đối tượng nghiên cứu là apigenin có trong dược liệu Bán chi liên. Nghiên cứu được thực hiện trên 5 mẫu Bán chi liên thu mua tại Hà Nội, Nghệ An, Bình Định, Đắc Lắc và Thành phố Hồ Chí Minh. Tiến hành khảo sát các thông số cho quy trình định lượng. Từ đó, xây dựng và thẩm định quy trình định lượng apigenin và áp dụng quy trình này để xác định hàm lượng apigenin trong các mẫu thu thập được. Kết quả: Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng apigenin bằng phương pháp điện di mao quản với các thông số: Bước sóng phát hiện268 nm, Dung dịch đệm borat kiềm pH = 8,8, nồng độ đệm 40 mM, điện thế 15 kV, thời gian tiêm mẫu 2 s, nhiệt độ cột mao quản 25 0C, thời gian điện di 15 phút. Quy trình định lượng đạt tính đặc hiệu, tính phù hợp của hệ thống với RSD của mẫu chuẩn và mẫu thử sau 6 lần tiêm mẫu lần lượt là 3,11% và 2,96%, khoảng tuyến tính của apigenin ở nồng độ 20 – 150 μg/ml (R2 = 0,9995), độ lặp lại của phương pháp với RSD = 3,71%, độ đúng với tỷ lệ phục hồi cao. Sử dụng quy trình đã xây dựng xác định hàm lượng apigenin trong 5 mẫu dược liệu được thu mua tại Hà Nội, Nghệ An, Bình Định, Đắc Lắc và Thành phố Hồ Chí Minh thu được kết quả lần lượt là 1,82 mg/g, 0,60 mg/g, 2,74 mg/g, 3,07 mg/g, 2,85 mg/g. Kết luận Hàm lượng apigenin trong các mẫu Bán chi liên khá cao khoảng từ 1,80 – 3,10 mg/g, trong đó đặc biệt thấp ở mẫu Nghệ An (chỉ khoảng 0,60 mg/g). Từ khóa: Bán chi liên, apigenin, điện di mao quản. ABSTRACT QUANTITATIVE DETERMINATION OF APIGENIN IN THE HERBAL BAN CHI LIEN (SCUTELLARIA BARBATA D. DON) BY CAPILLARY ELECTROPHORESIS Ngo Thi Thanh Diep, Nguyen Thi Huyen Thuong * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 2 - 2014: 144 - 149 Objective: Quantitative procedure of apigenin by capillary electrophoresis method Materials and methods: Object in the study is apigenin in the herbal Ban chi lien. The study was made on 5 Ban chi lien samples purchased in Hanoi city, Nghe An, Binh Dinh, Dak Lak province and Ho Chi Minh city. Since then, development and evaluation of quantitative procedure apigenin is conducted by capillary electrophoresis methods. Using established and evaluated method for determination quantitative of apigenin in collected Ban chi lien samples. Results: Developed and evaluated the quantitative procedure of apigenin by capillary electrophoresis methods with parameters: wavelength detection 268 nm, buffer solution alkaline borate pH = 8.8, buffer concentration 40 mM, voltage 15 kV, sample injection time 2 s, capillary column temperature 25 0C, developed time 15 minutes. Quantitative procedure has specificity,compatibility of CE system with RSD of the standard * Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: DS.Ngô Thị Thanh Diệp ĐT: 01226671588 Email: thanhdiep73@yahoo.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 145 sample and samples are respectively 3.110% and 2.957%, linearity of apigenin is 20 –150 μg/ml (R2 = 0.9995), repeatability of the parameters of the method with RSD = 3.71%, the recovery rate was good. Applying the developed procedure to determine apigenin in 5 samples purchased at Hanoi City, Nghe An, Binh Dinh, Dak Lak province and Ho Chi Minh City, obtained results are respectively 1.82 mg/g, 0.60 mg/g, 2.74 mg/g, 3.07 mg/g, 2.85 mg/g. Conclusion: Apigenin concentrations in the samples Ban chi lien are quite high in range from 1.80 to 3.10 mg/g, but the one in Nghe An province is specially low (only about 0.60 mg/g). Keywords: Scutellaria barbata D. Don, apigenin, capillary electrophoresis. ĐẶT VẤN ĐỀ: Bán chi liên Scutellaria barbata D. Don là một loại cây thân thảo thuộc họ Hoa môi (Lamiaceae). Cây thuốc này có mặt trong nhiều bài thuốc dân gian với tác dụng thanh nhiệt giải độc, lợi tiểu tiêu sưng, giảm đau và chống khối u tân sinh. Các nghiên cứu về thành phần hóa học cho thấy sự có mặt của flavon apigenin – một flavon có tính kháng khuẩn, kháng viêm, chống ôxy hoá cao trong dược liệu Bán chi liên với hàm lượng đáng kể. Ở nước ta, Bán chi liên được nhân dân sử dụng nhiều nhưng nguồn dược liệu này chủ yếu vẫn nhập từ Trung Quốc, chưa có tiêu chuẩn kiểm tra chất lượng cho dược liệu.Vì vậy, mục tiêu của đề tài này là xây dựng quy trình định lượng apigenin trong dược liệu Bán chi liên để góp phần tiêu chuẩn hóa, kiểm soát chất lượng dược liệu này. Phương pháp điện di mao quản được lựa chọn do có tính chọn lọc cao cho phép xác định được chính xác hàm lượng của apigenin trong dược liệu. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng 5 mẫu dược liệu Bán chi liên được thu mua tại các địa phương: Hà nội (BCL1), Nghệ An (BCL 2), Đắc lắc (BCL 3),Bình định (BCL 4), Tp.HCM (BCL 5). Mất khối lượng do làm khô (h) của các mẫu dược liệu được xác định lần lượt là 12,45%; 12,14%; 12,02%; 12,25%; 12,77%. Hóa chất, dung môi Chất đối chiếu: Apigenin độ tinh khiết 95% do BM Dược liệu, khoa Dược, ĐH Y Dược TP. HCM cung cấp. Ethanol, ethyl acetat(TQ), methanol, natri hydroxyd, kali clorid, acid boric (Merck). Thiết bị Máy điện di mao quản, đầu dò UV Aligent CE 7100 (Đức), bể siêu âm Elma (Đức), cân phân tích Satorius TE 412, cân xác định độ ẩm Satorius MA 45. Phương pháp nghiên cứu: Tiến hành khảo sát các điều kiện để tiến hành điện di mao quảnnhư pH và nồng độ của dung dịch đệm, điện thế tiến hành điện di, thời gian tiêm mẫu, nhiệt độ cột mao quản, thời gian điện di để tìm ra các điều kiện thích hợp nhất. Xây dựng quy trình định lượng apigenin trong dược liệu: Chất đối chiếu: Cân chính xác 10 mg apigenin chuẩn, cho vào bình định mức 50 ml, hòa tan và điền đến vạch bằng MeOH, thu được dung dịch chuẩn C0 có nồng độ 200 µg/ml. Từ dung dịch chuẩn C0pha thành dung dịch chuẩn có nồng độ 100 µg/ml. Chuẩn bị mẫu thử: Cân chính xác 1 g dược liệu cho vào bình nón 250 ml, thêm chính xác 100 ml dung môi ethanol 50% và cân chính xác bình nón đến 0,01 g. Đun hồi lưu ở nhiệt độ 80 – 90 0C trong60 phút. Để nguội và cân, điều chỉnh khối lượng erlen đến khối lượng ban đầu bằng dung môi. Lắc đều và lọc nhanh qua giấy lọc khô. Bỏ 10 ml dịch lọc đầu, thu được dung dịch T. Lấy chính xác 50 ml dung dịch T, cô đến cắn. Hòa cắn vào 20 ml nước, siêu âm 10 phút, cho Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 146 vào bình lắng gạn lắc với 60 ml EtOAc (chia làm 3 lần, mỗi lần 20 ml). Gộp các dịch EtOAc, bốc hơi đến cắn khô. Hòa tan cắn vào MeOH, cho vào bình định mức 10 ml, điền đầy đến vạch bằng MeOH, siêu âm trong 5 phút. Lọc qua màng lọc 0,45 µm cho vào lọ đựng mẫu, siêu âm 3 phút trước khi cho vào máy. Điều kiện điện di: Máy điện di mao quản đầu dò UV Aligent CE 7100 Mao quản silicagel nung chảy 64,5 cm có chiều dài hiệu lực 56 cm, đường kính trong 50 µm (Aligent). Phát hiện apigenin ở bước sóng 268 nm. Dung dịch đệm borat kiềm pH = 8,8 Nồng độ đệm 40 mM Điện thế 15 kV Thời gian tiêm mẫu 2 s Nhiệt độ cột mao quản 25 0C Thời gian điện di 15 phút. Hàm lượng apigenin (mg/g) trong dược liệu khô được tính theo công thức: X = C c ×CorrA t ×10×100×100 CorrA c ×50×103 × (100− h) = 2×C c ×CorrA t CorrA c ×m× (100− h) Trong đó: CorrAc và CorAt lần lượt là diện tích đỉnh đã được chuẩn hóa của mẫu chuẩn và mẫu thử; Cc là nồng độ của mẫu chuẩn (μg/ml) và m là khối lượng dược liệu (g), h là mất khối lượng do làm khô của dược liệu (%). Quy trình định lượng sau khi xây dựng được thẩm định theo ICH về tính phù hợp của hệ thống, tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ lặp lại và độ đúng. Áp dụng quy trình đã xây dựng và thẩm định để xác định hàm lượng apigenin trong các mẫu Bán chi liên đã thu thập đươc. KẾT QUẢ Bước sóng phát hiện: Phổ UV tại thời gian di chuyển của pic apigenin trong mẫu đối chiếu có bước sóng hấp thụ cực đại tại 268 nm. Do đó, lựa chọn 268 nm là bước sóng phát hiện (hình 1,2) min0 2 4 6 8 10 12 14 mAU 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 DAD1 B, Sig=268,4 Ref=360,100 (THUONG 2012-07-14 05-29-22\010-0101.D) chuan Hình 1: Điện di đồ của mẫu đối chiếu apigenin Apigenin 9.858 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 147 nm220 240 260 280 300 320 340 360 380 mAU 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 *DAD1, 9.785 (3.0 mAU, - ) Ref=0.005 & 14.998 of 010-0101.D Hình 2: Phổ UV tại thời gian di chuyển của pic apigenin trong mẫu đối chiếu Lần lượt thay đổi một trong các điều kiện điện di (các điều kiện khác được cố định) như pH dung dịch đệm, nồng độ dung dịch đệm, điện thế, thời gian tiêm mẫu để xác định các điều kiện thích hợp cho quy trình. Kết quả cho thấy các điều kiện thích hợp là: pH dung dịch đệm: 8,8; Nồng độ dung dịch đệm: 40 mmol; Điện thế 15 kV; Thời gian tiêm mẫu 2 s; Nhiệt độ cột mao quản 25 0C; Thời gian điện di 15 phút. Hình 3: Điện di đồ của mẫu thử thu mua tại Tp.HCM với các điều kiện đã thiết lập. Quy trình định lượng với các điều kiện điện di đã được xác định trên được thẩm định các thông số sau: Tính tương thích của hệ thống: Sau khi bơm 6 lần 1 mẫu đối chiếu, 1 mẫu thử qua hệ thống, RSD của thời gian di chuyển thu được lần lượt là 0,70% và 0,79%, RSD của diện tích pic là 3,11% và 2,96%. Tính đặc hiệu: Ở điện di đồ của mẫu thử và mẫu chuẩn đều có pic apigenin với cùng thời gian di chuyển. Điện di đồ của mẫu thử thêm chuẩn ở cùng thời gian di chuyển của apigenin có sự tăng diện tích pic.Mặt khác điện di đồ mẫu trắng không có pic nào khác trùng với pic apigenin trong điện di đồ mẫu chuẩn.Từ đó cho thấy quy trình có tính đặc hiệu. Khoảng tuyến tính: Từ dung dịch chuẩn C0pha các dung dịch chuẩn có nồng độ khoảng 20 µg/ml, 40 µg/ml, 80 µg/ml, 100 µg/ml, 150 µg/ml trong MeOH. Tiến hành điện di dung dịch chuẩn ở điều kiện đã khảo sát, thu được diện tích của pic apigenin tương ứng với từng nồng độ. Xử lý dữ liệu bằng Excel 2007 cho thấy có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và min0 2 4 6 10 12 14 mAU 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 DAD1 B, Sig=268,4 Ref=360,100 (THUONG 2012-07-14 06-26-49\010-0101.D) Apigenin 9.788 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 148 diện tích đỉnh được chuẩn hóa của các dung dịch chuẩn theo phương trình y = 0,0119x+0,0023. Sử dụng trắc nghiệm t cho thấy hệ số 0,0023 không có ý nghĩa thống kê, như vậy phương trình hồi quy được rút gọn y = 0,0119x; R2 = 0,9995 trong khoảng nồng độ apigenin từ 20 – 150 µg/ml. Hình 4:Đồ thị biểu diễn sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích đỉnh được chuẩn hóa của các dung dịch mẫu chuẩn Độ lặp lại: Tiến hành xác định hàm lượng apigenin trong 6 mẫu thử riêng biệt của mẫu dược liệu Bán chi liên thu mua tại TP.HCM (BCL5) có mất khối lượng do làm khô h=12,77%. Mẫu chuẩn được tiến hành song song có nồng độ thực tế là Cc = 95 µg/ml với CorrAc = 1,1525. Kết quả thu được thể hiện ở bảng 1 cho thấy quy trình có độ lặp lại tốt với RSD < 5%. Bảng 1: Kết quả khảo sát độ lặp lại Stt Khối lượng dược liệu (g) Diện tích đỉnh đã chuẩn hóa CorrA Hàm lượng Apigenin (mg/g) Kết quả xử lý thống kê 1 1,0005 1,3744 2,5962 n=6 = 2,7696 SD = 0,1028 RSD = 3,71% 2 1,0003 1,4579 2,7545 3 1,0004 1,4814 2,7986 4 1,0005 1,4826 2,8006 5 1,0004 1,5419 2,9129 6 1,0002 1,4579 2,7548 Độ đúng: Được khảo sát trên mẫu BCL5 đã dùng khảo sát độ lặp lại. Thêm vào các mẫu lượng chất đối chiếu apigenin tương ứng với khoảng 80%, 100%, 120% hàm lượng apigenin trong mẫu thử.Kết quả độ phục hồi thu được ở các mức chuẩn thêm vào đều ở khoảng 93,39 – 96,06% cho thấy quy trình có độ đúng phù hợp. Sử dụng quy trình đã thẩm định trên để xác định hàm lượng apigenin trong các mẫu Bán chi liên thu mua được, kết quả thu được thể hiện ở bảng 2 cho thấy hàm lượng apigenin trong các mẫu BCL1, BCL3, BCL4, BCL5 khá cao (khoảng 1,80 – 3,10 mg/g). Mẫu BCL2 (thu mua tại Nghệ An) có hàm lượng apigenin rất thấp so với các mẫu BCL còn lại, chỉ khoảng 0,60 mg/g. Bảng 2: Kết quả xác định hàm lượng apigenin trong các mẫu BCL Mẫu Khối lượng dược liệu (g) Diện tích đỉnh đã chuẩn hóa, CorrA Hàm lượng apigenin thu được (mg/g) Hàm lượng trung bình (mg/g) BCL1 1,0005 0,8679 1,8444 1,8179 ± 0,0949 0,9997 0,8918 1,9018 1,0004 0,8058 1,7126 BCL2 1,0004 0,2560 0,5422 0,5979 ± 0,0745 1,0005 0,3223 0,6826 1,0000 0,2686 0,5691 BCL3 1,0005 1,3427 2,8394 2,7400 ± 0,0941 1,0002 1,2538 2,6522 0.9998 1,2893 2,7284 BCL4 1,0003 1,4938 3,1679 3,0696 ± 0,1021 0,9996 1,3967 2,9640 1,0000 1,4505 3,0770 BCL5 1.0002 1,3769 2,9377 2,8472 ± 0,0938 1,0004 1,2893 2,7502 1,0005 1,3379 2,8536 KẾT LUẬN Sau thời gian tiến hành đề tài chúng tôi thu được một số kết quả sau: Xây dựng được quy trình định lượng apigenin trong dược liệu Bán chi liên bằng phương pháp điện di mao quản CE. Thẩm định quy trình đã xây dựng Áp dụng quy trình đã xây dựng và thẩm định để xác định hàm lượng của apigenin trong một số mẫu Bán chi liên thu mua được. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 149 TÀI LIỆU THAM KHẢO: 1. ICH Harmonised Tripartite Guideline (2005), Validation of analytical procedures: text and methodology, Q2 (R1), pp. 1 - 13. 2. Marchart E, Krenn L, Kopp B (2003), Quantification of the flavonoids in Passiflora incarnata by capillary electrophoresis, J. Planta Med, Vol. 69 (5), pp 452-456. 3. Võ Thị Bạch Huệ, Vĩnh Định (2008), Hóa phân tích, tập 2, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, tr. 77 - 103. Ngày nhận bài báo: 10.12.2012 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 24.12.2013 Ngày bài báo được đăng: 10.03.2014
Tài liệu liên quan