Nghiên cứu nuôi cấy tế bào gốc vùng rìa giác mạc và niêm mạc má tự thân điều trị bệnh lý biểu mô giác mạc

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 24 NGHIÊN CỨU NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC VÙNG RÌA GIÁC MẠC VÀ NIÊM MẠC MÁ TỰ THÂN ĐIỀU TRỊ BỆNH LÝ BIỂU MÔ GIÁC MẠC Trần Công Toại*, Trần Thị Thanh Thủy*, Phan Kim Ngọc**, Diệp Hữu Thắng*** TÓM TẮT Đặt vấn đề: Một số bệnh lý khiếm khuyết tế bào vùng rìa giác mạc bẩm sinh hoặc mắc phải bởi các nguyên nhân như hội chứng Steven Johnson, phẫu thuật giác mạc nhiều lần, bỏng nhiệt hoặc hóa chất tạo sẹo giác mạc, nhiễm trùng, đeo contact lensdẫn đến phá hủy lớp biểu mô giác mạc gây giảm thị lực của bệnh nhân. Để điều trị hiệu quả, bệnh nhân cần phải tạo được lớp biểu mô giác mạc thay thế. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu: Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu loạt ca. Phương pháp nghiên cứu: Bệnh nhân được chia làm 2 nhóm dựa theo chỉ định để tiến hành ghép tế bào gốc. Nhóm 1: ghép “tấm biểu mô” được tạo thành từ niêm mạc má. Nhóm: ghép “tấm biểu mô” được tạo thành từ tế bào gốc vùng rìa giác mạc. Tế bào rìa giác mạc và niêm mạc má được thu nhận theo đúng tiêu chuẩn chọn mẫu và tạo tấm biểu mô theo qui trình. Đánh giá: Tế bào nuôi cấy được theo dõi dưới kính hiển vi đảo ngược pha, nhuộm mô học HE và nhuộm hóa mô miễn dịch với marker p63. Kết quả ghép tấm biểu mô trên bệnh nhân được theo dõi và dựa trên khám bề mặt giác mạc, đánh giá thị lực và kết quả tạo tân mạch giác mạc. Kết quả và bàn luận: Sau khi tiến hành nghiên cứu, chúng tôi đạt được một số kết quả như sau: - Nhóm 1: bề mặt nhãn cầu ổn định 6/7 mắt. Thị lực cải thiện nhưng không quá 1 hàng. - Nhóm 2: bề mặt nhãn cầu ổn định 22/23 ca. Thị lực cải thiện lớn hơn 2 hàng 20/23 ca. Kết quả này cho thấy tính hiệu quả của phương pháp điều trị như các tác giả khác trên thế giới. Kết luận: Chúng tôi đã sử dụng thành công kỹ thuật nuôi cấy tế bào gốc an toàn và hữu dụng, đặc biệt điều trị bệnh lý bề mặt nhãn cầu ở chuyên khoa mắt. Từ khóa: ghép tế bào gốc, niêm mạc má, rìa giác mạc. ABSTRACT CULTURE OF AUTOGRAFT LIMBAL CELLS AND CHEEK EPITHELIAL CELLS TO TREAT CORNEAL EPITHELIUM DISEASE Tran Cong Toai, Tran Thi Thu Thuy, Phan Kim Ngoc, Diep Huu Thang * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 2 - 2011: 24 - 30 Introduction: Some pathologies of corneal cell edge region may be of congenital origin such as Steven Johnson syndrome, or can be caused by mechanical or environment condition such as corneal multiple surgeries, chemicals that eventually generate infection due to different auto-immune reaction. All these condition may eventually lead to the destruction of cornea epithelial layer causing either a decrease or a total loss of vision. For an effective treatment, patients need to be regenerated the corneal epithelial layer. Materials and methods: Research design: Case series study Methods: Patients were divided into 2 groups to conduct stem cell transplantation: Group 1: graft “epithelial sheets” are made up of oral mucosa. Group 2: graft “epithelial sheets” are formed from stem cell of *Trường ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch, **Trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên- ĐH Quốc Gia Tp.HCM ***Bệnh viện Mắt Tp.HCM Tác giả liên lạc: PGS. TS. BS Trần Công Toại ĐT: 0913.914.672 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Nghiên cứu Y học Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 25 corneal area (limbal stem cell). Corneal cell edge and oral mucosa were included as standard sample and generate epithelial sheets in the protocol. Evaluation: Cells were monitored by inverted phase microscopy, HE staining and immune-histochemical staining by p63 marker. Results of the epithelial sheet transplant are monitored and evaluated by the corneal surface examination, vision and corneal new vessels. Results and discussion: After conducting research, we obtained the results as follows: - Group 1: Stable surface eyeball 6/7 eyes. Vision improved, but not more than 1 row. - Group 2: Stable surface eyeball 22/23 eyes. Vision improved, but not more than 2 row. This result shows the effectiveness of treatment in line with other international studies. Conclusion: We used a successfully technique which confirmed that cultured stem cells are safe and useful in the treatment of few eye pathological condition. Key words: stem cell transplantation, oral mucosa, of corneal area (limbal stem cell). ĐẶT VẤN ĐỀ Nghiên cứu tế bào gốc là một lĩnh vực mang tính thời sự hiện nay trên thế giới vì những tiềm năng ứng dụng to lớn của chúng trong lĩnh vực Y Sinh học(18,19,21,32). Tuy nhiên, tùy theo định hướng nghiên cứu của mỗi nhóm nghiên cứu, mỗi vùng miền và mỗi quốc gia mà khả năng nghiên cứu được tiến hành trên những quy mô nghiên cứu khác nhau. Ở nước ta nghiên cứu tế bào gốc đang từng bước được quan tâm bởi các nhà khoa học, các nhà nghiên cứu, các bác sĩ lâm sàng cũng như các nhà đầu tư chiến lược khoa học của nhà nước và đang được đầu tư vào lĩnh vực mới mẽ nhưng đầy triển vọng này(8). So với các nước trong khu vực, Việt Nam chúng ta bắt đầu xây dựng chiến lược, đào tạo đội ngũ chuyên gia, cơ sở hạ tầng và mức độ đầu tư cũng như những sản phẩm công nghệ tế bào gốc như quy trình công nghệ, công trình công bố khoa học chuyên ngành tuy nhiên vẫn chỉ ở điểm xuất phát. Nhờ vào sự giúp đỡ, chuyển giao kỹ thuật từ phòng thí nghiệm tiên tiến tại Nhật(21,22,23) chúng tôi có thể tiếp cận, triển khai các qui trình mới mẻ nhưng có giá trị vô cùng to lớn, thực hiện nghiên cứu ứng dụng tế bào vùng rìa giác mạc và niêm mạc má người tạo tấm biểu mô điều trị các bệnh lý tổn thương biểu mô giác mạc tự thân qua nuôi cấy(23,25,28). Thực hiện đề tài chúng tôi cần đạt các mục tiêu sau: Tạo tấm biểu mô giác mạc từ tế bào gốc vùng rìa và tế bào niêm mạc má. Đánh giá kết quả điều trị bệnh nhân tổn thương biểu mô giác mạc bằng ghép tấm biểu mô tự thân qua nuôi cấy tế bào gốc. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thiết kết nghiên cứu: nghiên cứu loạt ca. Các phương pháp nghiên cứu: Tạo màng collagen từ màng ối người(2,4,10,11,16,17,20,30). - Sản phụ phải được xét nghiệm âm tính với HIV, HBV, HCV, VDRL Mẫu được lấy ngay sau sanh, trữ trong lọ vô trùng có chứa dung dịch PBS (Phosphat Buffer Salin), kháng sinh, chuyển nhanh về phòng thí nghiệm. - Rửa màng ối trong dung dịch PBS cho đến khi sạch máu, sạch các mô sống không cần thiết. - Cắt màng ối thành từng mảnh khoảng 50cm2 và xử lý với dung dịch trypsin 0,25% - EDTA 0,02% trong 30 phút ở 37oC. - Cạo bỏ lớp tế bào biểu mô màng ối, tránh làm vỡ màng đáy. - Đánh giá hiệu quả bóc tách lớp tế bào biểu mô màng ối bằng phương pháp nhuộm hematoxylin và eosin (nhuộm H&E). - Màng collagen được bảo quản 12 tháng sau khi để khô tự nhiên và khử trùng bằng tia gamma. - Trải mẫu màng ối trên đĩa insert, để khô tự nhiên 2 giờ trong buồng cấy, ở nhiệt độ phòng. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 26 - Khảo sát màng ối sau xử lý bằng cách quan sát mô học và phân tích độc chất. Phương pháp trải màng collagen trên đĩa nuôi(1,14,26,31) Cắt màng collagen thành những mảnh có diện tích tương ứng bề mặt đĩa nuôi. Trải căng và áp sát màng collagen trên bề mặt đĩa nuôi (đĩa lồng - insert) sao cho mặt biểu mô hướng lên trên. Để khô tự nhiên trong tủ cấy. Đóng gói và khử trùng bằng chiếu xạ tia  từ nguồn Co60, suất liều 25 kGy(3,8,15). Các phương pháp nuôi cấy tế bào 3T3, tế bào vùng rìa giác mạc và tế bào niêm mạc má theo đúng qui trình ĐH Tokyo Dental College Ichikawa(5,7,23). Tạo tấm biểu mô giác mạc từ TBG vùng rìa giác mạc. Thu nhận mẫu tế bào vùng rìa giác mạc tại phòng mổ (Bệnh viện Mắt TP.HCM), cho vào dung dịch bảo quản Optisol GS, đặt trong hộp bảo quản lạnh 2-80C, chuyển nhanh về phòng thí nghiệm. Rửa 2 lần bằng dung dịch PBS. Cắt lọc mẫu mô. Nuôi trên đĩa insert đã trảii màng collagen từ màng ối và có feeder tế bào 3T3 trong môi trường SHEM (DEMEM/F12, 100µ/ml Streptomycine, 100U/ml Penicillin, 10ng/ml EGF, 5 µ/ml Insulin, 0,1 µ/ml Cholera toxin, 5% FBS). Mẫu mô có bờ biểu mô áp trên màng, nhỏ 2 giọt môi trường SHEM, ngày tiếp theo thêm 0,5ml môi trường, 2 ngày tiếp theo thay môi trường 1ml/đĩa insert và 1,5ml/đĩa 3T3. Từ 14-21 ngày tạo được tấm biểu mô có nhiều lớp tế bào có thể ghép lại cho bệnh nhân. Một phần mẫu giữ lại sau ghép đánh giá mô học và thực hiện hóa miễn dịch mô. Tạo tấm biểu mô giác mạc từ TBG niêm mạc má. Niêm mạc má được lấy từ BV. Mắt trên người tình nguyện d=0,8 cm đựng trong dung dịch Optisol GS giữ 40C mang về phòng thí nghiệm. Cắt lọc mẫu bớt phần mô dưới niêm mạc. Tạo ra thành các phần 2mm. Ủ trong dung dịch Dipase ở 40C trong 5 giờ sao cho Dipase có nồng độ 0,8UI/ml. Tách tế bào,đếm tế bào sống cấy trên đĩa insert (0,1 – 1 x 105 cells/ml). Thay môi trường SHEM mỗi 2 ngày, 1ml/đĩa insert và 1,5ml/đĩa tế bào 3T3. Mẫu được tiếp xúc không khí (airlifting) 3 ngày trước khi ghép. Từ 14-21 ngày tạo được tấm biểu mô có nhiều lớp tế bào có thể chuyển lại ghép cho bệnh nhân. Một phần mẫu giữ lại sau ghép đánh giá mô học và hóa miễn dịch mô. Điều trị bệnh lý biểu mô giác mạc và kết quả ghép điều trị 30 bệnh nhân tình nguyện(24,27,29,33). Bệnh nhân đến khám tại Bệnh viện Mắt TP. HCM có chỉ định ghép TBG sẽ được chuyển đến khoa Giác mạc. Bác sỹ chuyên khoa Giác mạc sẽ khám, hội chẩn để ra quyết định điều trị. Bệnh nhân được bác sĩ chuyên khoa giải thích đầy đủ các nhu cầu và phương pháp điều trị bằng giải pháp nuôi cây tế bào sau nuôi cấy, cam kết đồng ý theo mẫu. Nếu bệnh nhân bị tổn thương một mắt và mắt còn lại tốt sẽ được điều trị ghép TBG vùng rìa giác mạc. Nếu bệnh nhân bị tổn thương cả hai mắt và niêm mạc má còn tốt sẽ được điều trị ghép tấm biểu mô được nuôi cấy từ tế bào niêm mạc má. Bệnh nhân sẽ được làm các xét nghiệm tiền phẫu, khám nội khoa tổng quát, khám mắt (đặc biệt đánh giá tình trạng viêm, tân mạch và phim nước mắt). Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Nghiên cứu Y học Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 27 Lấy mẫu tế bào chuyển về phòng thí nghiệm xử lý và nuôi cấy tạo tấm biểu mô, hẹn trở lại ghép. Trong nghiên cứu này, chúng tôi: - Đánh giá bước đầu việc ứng dụng ghép tấm biểu mô điều trị bệnh lý bề mặt nhãn cầu. - Đánh giá chất lượng tấm biểu mô được tạo thành từ nuôi cấy tế bào gốc vùng rìa giác mạc hoặc từ tế bào niêm mạc má trên màng ối. Phân loại Bệnh nhân được chia làm 2 nhóm dựa theo chỉ định: - Nhóm 1: ghép “tấm biểu mô” được tạo thành từ tế bào niêm mạc má. - Nhóm 2: ghép “tấm biểu mô” được tạo thành từ tế bào gốc vùng rìa giác mạc. Quy trình chọn lọc bệnh nhân Tế bào gốc vùng rìa giác mạc: lấy từ kết mạc rìa cực trên 4x2 mm. Tế bào niêm mạc má: lấy từ niêm mạc má, đường kính 8mm. Mẫu được đặt trong môi trường chuyên chở và gửi đến bộ Phòng thí nghiệm Vật liệu Sinh Hình 1: Xử lý mẫu tế bào niêm mạc má Hình2: Đĩa insert dùng để nuôi cấy tế bào Hình 3.9: Tế bào niêm mạc má sau nuôi cấy 6 ngày Hình 3.10: Tế bào niêm mạc má sau nuôi cấy 10 ngày Hình 3.15: Màng ối trước cấy tế bào, nhuộm HE x 400 Hình 3.16: Màng ối sau nuôi cấy, nhuộm HE x400 Hình 3.17: Màng ối sau nuôi cấy, nhuộm P63 x 400 Hình 3.18: Tấm tế bào từ Y.Hori (Osaka, Nhật) Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 28 học, Bộ môn Mô - Phôi, Trường Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch thực hiện qui trình nuôi cấy. - Bệnh nhân sẽ được phẫu thuật ghép tấm biểu mô. - Bệnh nhân được điều trị ngoại trú, không phải nằm viện. Đánh giá: Đánh giá kết quả dựa trên khám bề mặt giác mạc, thị lực và tân mạch giác mạc (tân mạch được chia làm 4 độ: độ 1 là tân mạch vùng rìa, độ 2 là tân mạch vào giác mạc 3mm, độ 3 là tân mạch vào toàn bộ giác mạc, độ 4 vào toàn bộ giác mạc và thành bó tân mạch). Nhóm 1: Tấm biểu mô được tạo thành từ tế bào gốc vùng rìa giác mạc của 23 bệnh nhân (16 bệnh nhân mộng thịt tái phát, 4 bệnh nhân bỏng kiềm,1 bệnh nhân Stevens Johnson,1 bệnh nhân suy yếu tế bào gốc chưa rõ nguyên nhân và 1 bệnh nhân bị ong chích). Thời gian theo dõi trung bình 6,34 tháng. Nhóm 2: Tấm biểu mô từ tế bào niêm mạc má được nuôi cấy trên màng ối của 6 bệnh nhân (6 mắt) với hội chứng Stevens Johnson và một bệnh nhân bỏng hóa chất. Tổng cộng 7 mắt, thời gian theo dõi trung bình 18,4 tháng. KẾT QUẢ Nhóm 1: - Ghép tế bào gốc vùng rìa. - Thời gian theo dõi trung bình 6,34 tháng. - Bề mặt nhãn cầu ổn định 22/23 ca. Một ca bi nhiễm trùng sau mổ 07 ngày trên bệnh nhân nhiễm HIV (nhiễm trùng sau đó được điều trị ổn). - Thị lực cải thiện lớn hơn 2 hàng 20/23 ca (87%). - Tân mạch chưa phát triển 18/23 ca. - Độ 1: 3/23 ca, độ 2: 1/23 ca và độ: 4 1/23 Nhóm 2: - Ghép tế bào niêm mạc má. - Thời gian theo dõi trung bình 18,4 tháng. - Bề mặt nhãn cầu ổn định 6/7 mắt. - Tân mạch độ 1: 5/7 mắt, độ 2: 1/7 mắt, độ 3: 1/7 mắt. - Thị lực có cải thiện nhưng không quá 1 hàng. BÀN LUẬN Ghép tấm biểu mô được nuôi cấy từ tế bào gốc đã giúp giải quyết được những bệnh lý bề mặt nhãn cầu do suy yếu tế bào gốc vùng rìa giác mạc(6,9,12,13,34). Phối hợp với ghép giác mạc sẽ đem lại thị lực cho bệnh nhân tốt hơn và góp phần mang lại thành công của phẫu thuật ghép giác mạc. Cần điều trị tình trạng viêm bề mặt, tình trạng khô mắt thật tốt sẽ giúp mang lại kết quả tốt. Bệnh nhân cần được làm xét nghiệm tiền phẫu kiểm tra các bệnh liên quan miễn dịch ví dụ HIV, tiểu đường, viêm khớp,... nhằm tiên lượng và hướng điều trị. Hình 3.24: Mắt tổn thương sẹo giác mạc trước ghép Hình 3.25: Điều trị tổn thương sẹo giác mạc trước ghép Hình 3.26:Tế bào rìa giác mạc sau nuôi cấy, trước ghép Hình 3.27: Điều trị tổn thương sẹo giác mạc trước ghép Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Nghiên cứu Y học Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 29 Đối với bệnh nhân suy giảm miễn dịch cần rất thận trọng vì rất dễ bị nhiễm trùng do phải sử dụng corticoid sau mổ. Phẫu thuật không phức tạp nhưng đòi hỏi sự tỉ mỉ. Chọn bệnh nhân đúng chỉ định và theo dõi chặt chẽ. Với việc ứng dụng keo sinh học collagen sẽ giúp cho phẫu thuật đơn giản và hiệu quả hơn. Đa số trường hợp có tổn thương giác mạc nặng thì ghép tế bào gốc là bước đệm của việc ghép giác mạc sau này. KẾT LUẬN Thành công của kỹ thuật nuôi cấy tế bào gốc. Phẫu thuật an toàn và hữu dụng, đặc biệt ở những trường hợp mộng thịt tái phát, những trường hợp hội chứng Stevens Johnson có đục giác mạc cần phẫu thuật ghép giác mạc sau đó nhằm đem lại thị lực cho bệnh nhân. Mở ra một hướng mới trong việc ứng dụng tế bào gốc điều trị bệnh lý bề mặt nhãn cầu. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Ariane R, Yann B. (2006): Essentials of stem cell biology, Elsevier, Inc.: 440 – 444. 2. Azuara BA, Pillai CT, Dua HS. (1999) : Amniotic membrane transplantation for ocular surface reconstruction, Br J Ophthalmol, 83: 399-402. 3. Bacakova L, Filova E, Rypacek F, Svorcik V, Stary V. (2004): Cell adhesion on artificial materials for tissue engineering. Physiol Res, 53: 35-45. 4. Chen HJ, Pires RT, Tseng SC. (2000): Amniotic membrane transplantation for severe neurotrophic corneal ulcers, Br J Ophthalmol, 84: 826-833. 5. Der-Yuan W, Yi-Jen H, Vivian CY, Jan-Kan C. (2003): Propagation and phenotypic preservation of rabbit limbal epithelial cells on amniotic membrane, Investigative Ophthalmology and Visual Science, 44: 4698- 4704. 6. Higa K, Shimazaki J. (2008): Recent advances in cultivated epithelial transplantation, Cornea, 27(1):S41-47. 7. Higa K, Shimmura S, Kato N et al. (2007): Proliferation and differentiation of transplantable rabit epithelial sheets engineered with or without an amniotic membrane carrier, Invest Ophtalmol Vis Sci, 48: 597–604. 8. Higa K, Shimmura S, Shimazaki J, Tsubota K. (2005): Hyaluronic acid-CD44 interaction mediates the adhesion of lymphocytes by amniotic membrane stroma, Cornea, 24: 206-212. 9. Higa K, Shimmura S, Shimazaki J, Tsubota K. (2006): Ocular surface epithelial cells up-regulate HLA-G when expanded in vitro on amniotic membrane substrates, Cornea, 25: 715-721. 10. Hopkinson A, Shanmuganathan VA, Gray T, Yeung AM, Lowe J, James DK, Dua HS. (2008): Optimization of amniotic membrane (AM) denuding for tissue engineering, Tissue engineering, 14: 371-383. 11. Hori J, Wang M, Kamiya K, Takahashi H, Sakuragawa N. (2006): Immunological characteristics of amniotic epithelium, Cornea, 25:53- 58. 12. Kevin YH Chee, Anthony Kicic, Steven J Wiffen. (2006): Limbal stem cells: the search for a marker, Clinical and Experimental Ophthalmology, 34: 64–73. 13. Koizumi NJ, Inatomi TJ, Quantock AJ. (2000): Amniotic membrane as a substrate for cultivating limbal epithelial cells for autologous transplantation in rabbits, Cornea, 19: 65-71 14. Kruse FE, Joussen AM, Rohrschneider K, You L, Sinn B, Baumann J, Volcker HE. (2000): Cryopreserved human amniotic membrane for ocular surface reconstruction, Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, 238: 68-75. 15. Kubo M, Sonoda Y, Muramatsu R, Usui M. (2001): Immunogenicity of human amniotic membrane in experimental xenotransplantation, Invest Ophthalmol Vis Sci, 42:1539-1546. 16. Manabe Y, Himeno N, Fukumoto M. (1991): Tensile strength and collagen content of amniotic membrane do not change after the second trimester or during delivery, Obstet Gynecol, 78: 24-27. 17. Meller D, Tseng SCG. (1999): Stratified Conjunctival Epithelial Cell Differentiation on Amniotic Membrane, Investigative Ophthalmology & Visual Science, 40: 878-886. 18. Miki T, Lehmann T, Cai H, Stolz DB, Strom SC. (2005): Stem cell characteristics of amniotic epithelial cells, Stem Cells, 23: 1549-1559. 19. Miyamoto K, Hayashi K, Suzuki T, Ichihara S, Yamada T, Kano Y, Yamabe T, Ito Y. (2004): Human placenta feeder layers support undifferentiated growth of primate embryonic stem cells, Stem Cells, 22: 433-440. 20. Rita S, Sumita P, Chacharkar MP. (2007): Effect of high doses of gamma radiation on the functional characteristics of amniotic membrane, Rad Phys Chem, 76:1026 – 1030. 21. Satake Y, Dogru M, Yamane GY et all. (2008): Barrier function and cytologic features of the ocular surface epithelium after autologous cultivated oral mucosal epithelial transplantation, Arch Ophthalmol, 126: 23-8. 22. Shimazaki J, Aiba M, Goto E et all. (2002): Transplantation of human limbal epithelium cultivated on amniotic membrane for the treatment of severe ocular surface disorders, Ophthalmology, 109:1285-90. 23. Shimazaki J, Higa K, Kato N et all. (2009): Barrier function of cultivated limbal and oral mucosal epithelial cell sheets, Invest Ophthalmol Vis Sci, 50:5672-80. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011 Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011 30 24. Shimazaki J, Higa K, Morito F et all. (2007):Factors influencing outcomes in cultivated limbal epithelial transplantation for chronic cicatricial ocular surface disorders, Am J Ophthalmol, 143: 945-53. 25. Shimazaki J, Maruyama F, Shimmura S et all. (2001): Immunologic rejection of the central graft after limbal allograft transplantation combined with penetrating keratoplasty, Cornea, 20:149-52. 26. Shimazaki J, Shimmura S, and Tsubota K. (2002): Limbal stem cell transplantation for the treatment of subepithelial amyloidosis of cornea (gelatinous drop-like dystrophy), Cornea, 21:177-80. 27. Shimazaki J, Shimmura S, Tsubota K. (2004): Donor source affects the outcome of ocular surface reconstruntion in