Xây dựng tiêu chuẩn kỹ thuật kiểm nghiệm mỹ phẩm chứa thành phần làm trắng da – Acid kojic

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 463 XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN KỸ THUẬT KIỂM NGHIỆM MỸ PHẨM CHỨA THÀNH PHẦN LÀM TRẮNG DA – ACID KOJIC Nguyễn Thị Phương Thùy*, Vĩnh Định* TÓM TẮT Mục tiêu: Định tính và định lượng kojic dipalmitat bằng phương pháp HPLC trong nguyên liệu kojic dipalmitat và trong các mỹ phẩm. Phương pháp: Sắc ký (SK lớp mỏng và SK lỏng hiệu năng cao). Kết quả: định tính bằng SKLM với hệ dung môi benzen – ethylacetate (9:1) cho kết quả tách Kojic dipalmitat ra khỏi các chất khác có trong mỹ phẩm. Định lượng bằng SK lỏng hiệu năng cao (SKLHNC) với cột RP-C8, 250 x 4,6 mm (5 μm), pha động: MeOH – THF (85:15), thể tích bơm mẫu 10 μl, phát hiện bằng PDA ở 250 nm, tốc độ dòng: 1 ml/phút. Qui trình định lượng này đã được thẩm định với các yếu tố như: tính thích hợp hệ thống, tính đặc hiệu, độ chính xác (RSD = 0,9%), độ đúng (đạt tỉ lệ phục hồi lý thuyết 97 – 103%). Tiêu chuẩn kỹ thuật kiểm nghiệm cho 2 mỹ phẩm chứa kojic dipalmitat đã được dự thảo để ứng dụng. Kết luận: Dự thảo tiêu chuẩn kỹ thuật kiểm nghiệm cho hai mỹ phẩm chứa kojic dipalmitat đã được áp dụng để đăng ký sản phẩm. Từ khóa: acid kojic, kojic dipalmitat. ABSTRACTS DEVELOPMENT IN-HOUSE SPECIFICATIONS FOR SKIN-WHITENING COSMETIC PRODUCTS CONTAINING KOJIC ACID Nguyen Thi Phuong Thuy, Vinh Dinh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 463 - 468 Objectives: To qualify and quantity kojic dipalmitate in materials and in preparatives by HPLC. Methods: Development and validation of HPLC are used Results: In qualification with solvent system benzen – ethylacetate (9:1) causes good resolution for separation of kojic dipalmitate from the other compounds in cosmetics. In quantitaion by HPLC, the following condition has been apllied: column RP-C8, 250 x 4.6 mm (5 μm), mobile phase MeOH – THF (85:15), injection volume 10 μl, PDA at 250 nm, flow rate 1 ml/min. This procedure has been validated with the following factors: the system suitability, specificity, precision (RSD = 0.9%), accuracy (theory recovery ratio 97 – 103%). The specifications of 2 cosmetics contained kojic dipalmitate has been applied. Conclusions: the specifications of two cosmetics contained kojic dipalmitate has been applied to register the products. Keywords: kojic acid, kojic dipalmitate. ĐẶT VẤN ĐỀ Mỹ phẩm trước hết phải an toàn cho người sử dụng. Chính vì vậy, trước khi được lưu hành trên thị trường, mỹ phẩm phải được xét duyệt các tiêu chuẩn nghiêm ngặt(4). Bản tiêu chuẩn mỹ phẩm có thể theo tiêu chuẩn Việt Nam hay tiêu chuẩn cơ sở mà nhà sản xuất quy định và là cơ sở để Cục Quản Lý Dược dựa vào đó xét duyệt mỹ phẩm có đủ tiêu chuẩn để lưu hành trên thị *Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS. TS. Vĩnh Định ĐT: 0903639586; Email: npvdinh@yahoo.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 464 trường hay không. Vì vậy, việc xây dựng bản tiêu chuẩn cho từng sản phẩm là hết sức cần thiết. Trong các tiêu chuẩn của mỹ phẩm làm trắng da, tiêu chuẩn định lượng hàm lượng thành phần chính có tác dụng trong mỹ phẩm làm trắng da là cần thiết nhằm tránh mỹ phẩm kém chất lượng và tạo sự tin tưởng cho người sử dụng. Trong các hợp chất có tác dụng làm trắng da, kojic dipalmitate là hợp chất mới được chú ý gần đây. Với những ưu điểm như độ ổn định cao với nhiệt độ, pH, sự oxy hóa, bền màu theo thời gian và có tác dụng tốt trong việc làm trắng da, hai chất trên ngày càng được quan tâm và sử dụng ngày càng phổ biến trong các mỹ phẩm làm trắng da(1). Đề tài này thực hiện nhằm nâng cao chất lượng mỹ phẩm chứa chất làm trắng da là kojic dipalmitat. ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU * Mỹ phẩm làm trắng da chữa nám Xuân Thịnh (sản xuất thử): - Mỹ phẩm A: mỹ phẩm làm trắng da Xuân Thịnh, dạng hỗn dịch. Mỹ phẩm A có chứa kojic dipalmitate 1% (số lô XT1-010510). - Mỹ phẩm B: mỹ phẩm chứa nám Xuân Thịnh, dạng nhũ tương. Mỹ phẩm B có chứa kojic dipalmitate 1% và acid azelaic 0.2% (số lô XT2-010710). * Kojic dipalmitate của nhà sản xuất Green Leaf, Thái Lan, hàm lượng 99,23%, độ ẩm 0.11% (không ghi số lô). * Đối tượng nghiên cứu: Mỹ phẩm làm trắng da Erin của nhà sản xuất Phương Nghĩa. Mỹ phẩm làm trắng da X-way của Trung Quốc. * Tiến hành xây dựng các chỉ tiêu theo qui định trong Phụ lục thuốc mỡ - kem của DĐVN IV. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Định lượng kojic dipalmitat trong mỹ phẩm bằng phương pháp SKLHNC Dung dịch kojic dipalmitate chuẩn Cân chính xác khoảng 0,01 g kojic dipalmitate chuẩn, hòa tan và điền đầy trong bình định mức 50 ml bằng THF. Hút chính xác 10 ml dung dịch trên cho vào bình định mức 50 ml. Thêm pha động đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 μm. Dung dịch thu được chứa 40 μg/ml kojic dipalmitate(3). Dung dịch thử Cân chính xác khoảng 1 g mỹ phẩm A, hòa tan và điền đầy trong bình định mức 50 ml bằng THF. Lọc dung dịch trên, bỏ 10 ml dịch lọc đầu. Hút chính xác 10 ml dung dịch trên cho vào bình định mức 50 ml. Thêm pha động đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 μm. Điều kiện sắc ký Hệ thống HPLC Alliance Waters 2695; Đầu dò PDA Waters 2996; Cột C8, 250 x 4,6 mm; 5 μm; Pha động: MeOH – THF (85:15); Thể tích bơm mẫu: 10 μl; Bước sóng phát hiện: 250 nm; Tốc độ dòng: 1 ml/phút; Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng. Tính hàm lượng kojic dipalmitat trong mỹ phẩm theo công thức: P (%): lượng kojic dipalmitate trong 100 g mỹ phẩm; SC:: diện tích đỉnh mẫu chuẩn; ST: diện tích đỉnh mẫu thử; mC: lượng cân của mẫu chuẩn; mT: lượng cân của mẫu thử; AC: hàm lượng của chất chuẩn, Ac = 99,23%. Tính thích hợp hệ thống Bảng 1. Khảo sát tính thích hợp hệ thống trên mẫu chuẩn (6 lần tiêm mẫu) tR S k’ RS T N TB 5.67 423052.084 2.24 1.73 1.14 11673 SD 0.01 1495.185 0.01 0.004 0.01 116 RSD% 0.15 0.353 0.35 0.24 0.83 1 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 465 Tính đặc hiệu Hình 1. Sắc ký đồ và phổ UV mẫu mỹ phẩm A và mẫu A thêm chuẩn Độ chính xác Bảng 2. Kết quả độ lặp lại hàm lượng kojic dipalmitate trong mỹ phẩm A n Diện tích đỉnh Hàm lượng KDP (%) Xử lý kết quả 1 402760.17 0.94 2 397210.62 0.93 3 396809.04 0.93 4 397938.98 0.93 5 396458.50 0.93 6 396646.18 0.93 TB 397970.58 0.93 SD 2404.51 0.01 RSD% 0.60 0.59 Số lần thực nghiệm n = 6 n = 6; P = 0,95 Æ t = 2,57 e = ± (2,57.0,01) / e = ± 0,01% Khoảng tin cậy: μ = 0,93% ± 0,01% Độ đúng Bảng 3. Kết quả độ đúng hàm lượng kojic dipalmitat trong mỹ phẩm A Nồng độ (mcg/ml ) Lượng KDP chuẩn thêm vào (mg) Lượng KDP chuẩn tìm thấy (mg) Tỷ lệ phục hồi (%) Tỷ lệ phục hồi trung bình (%) 3,9692 4,098595 103.26 3,9692 3,944416 99.38 32 3,9692 4,073824 102.64 101.76 4,9615 4,763454 96.01 4,9615 5,193256 104.67 40 4,9615 5,015469 101.09 100.59 5,9538 5,937108 99.72 5,9538 6,005102 100.86 48 5,9538 5,820562 97.76 99.45 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 466 Khoảng tuyến tính Bảng 4. Tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh của kojic dipalmitat Nồng độ (μg/ml) Diện tích đỉnh 100 1025118.26 90 936565.12 80 817075.99 60 617064.43 40 420106.12 30 300916.22 20 211341.31 16 168947.45 10 110759.25 Hình 2. Đồ thị biểu diễn tương quan tuyến tính của kojic dipalmitat Quy trình định lượng kojic dipalmitat trong mỹ phẩm A bằng phương pháp SKLHNC đạt các yêu cầu tính đặc hiệu, độ đúng, độ chính xác của một quy trình kiểm nghiệm. Kết luận: Dự thảo tiêu chuẩn kỹ thuật kiểm nghiệm cho mỹ phẩm chứa kojic dipalmitat đã được áp dụng để đăng ký sản phẩm như sau. Yêu cầu kỹ thuật Công thức pha chế cho một hộp 10 g kem Kojic dipalmitat: 100 mg Tá dược: vừa đủ 10 g Nguyên, phụ liệu Kojic dipalmitat: đạt tiêu chuẩn dược dụng. Tá dược: đạt tiêu chuẩn dược dụng. Chất lượng thành phẩm Cảm quan Dạng kem mịn, đồng nhất, không có tạp chất lạ, không biến màu, không cứng lại hay tách lớp ở điều kiện thường, không được chảy lỏng ở nhiệt độ 37 0C và phải bắt dính được trên da khi bôi. Kem có màu cam đồng nhất và có mùi thơm dễ chịu, đặc trưng, không có mùi lạ. Độ ổn định ở 40 ± 2 0C trong 24 giờ Thử với 5 hộp kem. Không được có hộp kem nào trong 5 hộp tách lớp, biến màu hay có mùi lạ. Độ đồng đều khối lượng ± 15% so với khối lượng nhãn. Độ đồng nhất Trên 4 đơn vị đóng gói, 3 đơn vị không được thấy các tiểu phân. Không được có phần tử nào có φ > 75 μm. Giới hạn acid – kiềm Dung dịch kem 1% có pH trong khoảng 5 ± 1. Giới hạn kim loại nặng Hàm lượng Pb ≤ 2 ppm (2 mg/kg). Định tính kojic dipalmitat Phải có phản ứng đặc trưng của kojic dipalmitat. Định lượng Hàm lượng kojic dipalmitat phải nằm trong khoảng 90 – 110% hàm lượng ghi trên nhãn. Phương pháp thử Hình thức Trải 2 g chế phẩm lên mặt kính đồng hồ. Cần tiến hành ở nơi có đủ ánh sáng, tránh ánh sáng trực tiếp, không có màu sắc khác ở gần và không có mùi lạ. Quan sát bằng mắt thường. Kem phải đạt các yêu cầu đã nêu. Độ ổn định ở 40 ± 2 0C trong 24 giờ Đặt đứng 5 hộp kem còn nguyên hộp giấy ở giữa tủ sấy ở 40 ± 2 0C trong 24 giờ. Sau 24 giờ, lấy 5 hộp kem ra, quan sát bằng mắt thường, phải đạt yêu cầu đã nêu. Độ đồng đều khối lượng Thử theo DĐVN IV (phụ lục 11.3) Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 467 Độ đồng nhất Lấy 0,02 – 0,03 g chế phẩm để trên lam, dùng lam khác ép mạnh tạo một hình tròn đường kính khoảng 2 cm. Quan sát bằng mắt thường. Trên 4 đơn vị đóng gói, 3 đơn vị không được thấy các tiểu phân. Nếu có tiểu phân phải làm lần 2 trên 8 đơn vị đóng gói khác. Không được có > 2 tiêu bản có tiểu phân nhìn thấy được. Sau đó, soi lam dưới kính hiển vi chuyên dụng có trắc vi thị kính. Không được có phần tử nào có φ > 75 μm. Giới hạn acid – kiềm Cân 0,5 g chế phẩm cho vào bercher + 50ml H2O đã đun sôi còn ấm khoảng 500C. Để nguội đến lạnh cho lớp dầu mỡ đông đặc, lọc loại bỏ lớp dầu mỡ, lấy phần nước. Lấy dịch H2O thử pH sơ bộ với giấy quỳ. Chuẩn điện cực với 2 dung dịch đệm mà pH thử sơ bộ nằm trong khoảng đó. Lấy dịch nước đo pH. Giới hạn kim loại nặng Cân chính xác khoảng 10 g chế phẩm cho vào chén nung, thêm 5 ml H2SO4 đậm đặc, đun đến cạn trên bếp điện. Đốt cẩn thận trên bếp điện ở nhiệt độ thấp đến khi mẫu thử hóa than hoàn toàn. Để nguội, thêm 2 ml HNO3 đậm đặc và 5 giọt H2SO4 đậm đặc, tiếp tục đốt tới khi không còn khói trắng bốc ra. Nung ở 700 0C tới khi mẫu hoàn toàn bị đốt cháy thành tro (khoảng 1 giờ). Để nguội, lấy chén nung ra, khuấy kỹ cắn 2 lần trên bếp cách thủy, mỗi lần với 5 ml dung dịch acid hydrocloric 2 N (TT) trong 15 phút và lần cuối với 5 ml nước cất. Gạn dung dịch trong vào cốc có mỏ, bốc hơi trên bếp cách thủy đến khi còn khoảng 5 ml. Thêm 2 giọt dung dịch phenolphtalein (CT), rồi cho từng giọt amoniac đậm đặc (TT) đến khi có màu hồng. Làm nguội, thêm acid acetic băng (TT) đến khi mất màu dung dịch, rồi thêm 0.5 ml nữa. Lọc nếu cần rồi pha loãng dung dịch với nước cất vừa đủ 20 ml, dùng dung dịch này tiến hành thử theo phương pháp 1, PL 9.4.8, DĐVN IV. Định tính kojic dipalmitat Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,01 g kojic dipalmitate chuẩn, hòa tan và điền đầy trong bình định mức 20 ml bằng THF. Dung dịch thử:cân chính xác khoảng 1 g mỹ phẩm, hòa tan và điền đầy trong bình định mức 20 ml bằng THF. Lượng chấm: khoảng 2 μl Dung môi khai triển: CHCl3 – CH3OH – CH3COOH (99:1:1 giọt). Phát hiện: soi UV 254 nm. Trên sắc ký đồ, mẫu thử phải có vết có cùng màu sắc, hình dạng và Rf với mẫu chuẩn. Định lượng Trộn đều 5 hộp kem bằng cối chày. Lấy hỗn hợp này để chuẩn bị dung dịch thử. Chuẩn bị mẫu Dung dịch kojic dipalmitate chuẩn: cân chính xác khoảng 0,01 g kojic dipalmitate chuẩn, hòa tan và điền đầy trong bình định mức 50 ml bằng THF. Hút chính xác 10 ml dung dịch trên cho vào bình định mức 50 ml. Thêm pha động đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 μm. Dung dịch thu được chứa 40 μg/ml kojic dipalmitate trong 1 ml. Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 1 g mỹ phẩm A, hòa tan và điền đầy trong bình định mức 50 ml bằng THF. Lọc dung dịch trên, bỏ 10 ml dịch lọc đầu. Hút chính xác 10 ml dung dịch trên cho vào bình định mức 50 ml. Thêm pha động đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 μm. Định lượng kojic dipalmitat bằng phương pháp HPLC: cột C8, 250 x 4,6 mm; 5 μm; pha động: MeOH – THF (85:15); thể tích bơm mẫu: 10 μl; bước sóng phát hiện: 250 nm; tốc độ dòng: 1 ml/phút. Tính hàm lượng kojic dipalmitat trong mỹ phẩm theo công thức: Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 468 P (%): lượng kojic dipalmitate trong 100 g mỹ phẩm; SC:: diện tích đỉnh mẫu chuẩn; ST: diện tích đỉnh mẫu thử; mC: lượng cân của mẫu chuẩn; mT: lượng cân của mẫu thử; AC: hàm lượng của chất chuẩn Đóng gói – Ghi nhãn – Bảo quản Đóng gói: hộp nhựa chứa kem, bao bì cấp 2 là hộp giấy. Nhãn: rõ ràng, đúng qui cách Bảo quản: Nơi khô mát. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Beélik A and Purves CB (1955), “Some new reactions and derivatives of kojic acid”, Canadian Journal of Chemistry, volume 33, 1361-1373. 2. Bộ Y Tế (2009), Dược Điển Việt Nam IV, Nhà xuất bản Y Học, Hà Nội, PL1.12, PL 5, PL 9.4, PL 11.3. 3. Công ty RUEI GUANG RD, Bản tiêu chuẩn nguyên liệu kojic dipalmitat, Đài Bắc, Đài Loan. 4. Hiệp định về Hệ Thống Hòa Hợp ASEAN trong Quản lý mỹ phẩm (Agreement on ASEAN Harmonnized Cosmetic Regulatory Scheme)