Nghiên cứu tác động của 3-monochloropropan-1,2-diol (3-MCPD) trên sự biểu hiện của c-FOS

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 318 NGHIÊN CỨU TÁC ĐỘNG CỦA 3-MONOCHLOROPROPAN-1,2-DIOL (3-MCPD) TRÊN SỰ BIỂU HIỆN CỦA c-FOS Ngô Kiến Đức*, Đặng Thị Trúc Giang*, Nguyễn Văn Thanh*, Trần Mạnh Hùng* TÓM TẮT Mục tiêu: 3-MCPD được hình thành do kết quả của quá trình phản ứng giữa chất béo với một nguồn có chứa chlorin (Cl-) trong thực phẩm hoặc phản ứng với một thành phần nào đó trong thực phẩm dưới sự xúc tác của nhiệt độ. Ngoài ra, quá trình thủy phân protein thực vật bằng acid hydrochloric (HCl) trong sản xuất nước tương còn là nguồn phổ biến tạo ra độc tố 3-MCPD. Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh độc tính của 3-MCPD trên thận, cơ quan sinh dục và tiềm năng gây ung thư. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành theo dõi độc tính của 3-MCPD trên sự biểu hiện của c-fos (một gen tiền ung thư) trên não chuột nhắt. Phương pháp: Chuột nhắt trắng được cho uống 3-MCPD ở các liều 10 mg/kg, 50 mg/kg và 100 mg/kg. Sau 24, 48 và 72 giờ, não chuột được tách ra và khảo sát sự biểu hiện c-fos. Kết quả: Chỉ có 3-MCPD liều 100 mg/kg mới gây biểu hiện c-fos và sự biểu hiện này được quan sát rõ nhất ở thời điểm 48 giờ, ít hơn ở thời điểm 72 giờ. 3-MCPD liều 10 mg/kg và 50 mg/kg không gây biểu hiện c-fos ở bất kỳ thời điểm nào đã khảo sát. Kết luận: Độc tính của 3-MCPD trên não vẫn chưa thể hiện rõ ở các liều lượng và phương pháp khảo sát. Từ Khóa: 3-MCPD, c-fos, hóa mô miễn dịch ABSTRACT EFFECT OF 3-MONOCHLOROPROPAN-1,2-DIOL (3-MCPD) ON THE EXPRESSION OF c-FOS PROTEIN Ngo Kien Duc, Dang Thi Truc Giang, Nguyen Van Thanh, Tran Manh Hung * Y Hoc TP. Ho Chi Minh* Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 318 - 323 Objective: 3-MCPD is a toxic chemical formed as a result of the reation between a lipid (triglyceride) and a chlorine (Cl-) in foods (sodium chloride, hydrochloric acid). Besides, 3-MCPD is also popularly produced by acid- hydrolyzed protein processes. There are bodies of evidence showing toxic effects of 3-MCPD on kidney, reproductive organs and carcinogenic property. In this study, we investigated the effect of 3-MCPD on c-fos expression (a proto-oncogene) in mouse brain. Method: mice were orally administered 3-MCPD at doses of 10 mg/kg, 50 mg/kg or 100 mg/kg. After 24, 48, or 72 hours of 3-MCPD administration, brain was fixed and stained immunohistochemically with c-fos antibody. Results: 3-MCPD at the only dose of 100 mg/kg induced c-fos expression, whereas 3-MCPD at doses of 10 mg/kg or 50 mg/kg did not. Conclusion: Toxicity of 3-MCPD on brain did not exert clearly at doses and methods investigated. Keywords: 3-MCPD, c-fos, immunohistochemistry ĐẶT VẤN ĐỀ 3-Monochloropropane-1,2-diol (3-MCPD) là một sản phẩm phụ trong quá trình sản xuất nhiều loại thực phẩm. 3-MCPD được hình thành từ phản ứng giữa chất béo và ion Cl- ở *Bộ Môn Sinh hóa, Khoa Dược, ĐH Y Dược TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên hệ: ThS. Ngô Kiến Đức ĐT: 0903055357 Email: ngokienduc@gmail.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 319 nhiệt độ cao(5). Ngoài ra, 3-MCPD cũng được tạo ra trong quá trình thủy phân protein thực vật bằng acid hydrochloric (HCl)(4). 3-MCPD thường hiện diện ở hàm lượng rất thấp (<1 mg/kg) nhưng một vài loại sản phẩm có thể chứa với hàm lượng cao (lên đến hàng trăm mg/kg). Cho đến nay, các nhà khoa học chỉ mới xác định được rằng: với nồng độ 3-MCPD ở mức tối thiểu 1,1 mg/kg thể trọng, có thể gây thương tổn hệ sinh sản của chuột cống đực, thương tổn dạng tăng sinh và tạo khối u ở thận trên mô hình thực nghiệm động vật(6). Trên thần kinh trung ương, một số nghiên cứu cho thấy 3-MCPD gây nhiều tổn thương trên chất xám, trải dài từ vỏ não cho đến cột sống, làm tăng thể tích nước trong bào tương, gây phù các tế bào hình sao(1,2,3). Do một số công trình nghiên cứu cho thấy 3- MCPD có thể gây độc tính trên thần kinh, vì thế trong nghiên cứu này chúng tôi đặt mục tiêu theo dõi tác dụng của 3-MCPD trên não chuột nhắt sau khi cho chuột uống 3-MCPD ở một số liều khác nhau. Để đánh giá mức độ độc hại trên não, chúng tôi ứng dụng phương pháp hóa mô miễn dịch trên biểu hiện c-fos (một gen tiền ung thư) để tiến hành thí nghiệm. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thú vật thử nghiệm Thú vật thử nghiệm là chuột nhắt trắng, chủng Swiss albino, giống đực, có trọng lượng từ 18-20 g, được phân bố ngẫu nhiên thành nhiều lô khác nhau, mỗi lô từ 6. Chuột được nuôi trong môi trường tiến hành thực nghiệm từ 3-5 ngày để thích nghi với môi trường. Chuột thí nghiệm được chia thành các nhóm sau: Nhóm chứng: uống nước sinh hoạt, n = 6 Nhóm 1: uống 3-MCPD 10 mg/kg/ngày pha trong nước uống sinh hoạt Nhóm 2: uống 3-MCPD 50 mg/kg/ngày pha trong nước uống sinh hoạt Nhóm 3: uống 3-MCPD 100 mg/kg/ngày pha trong nước uống sinh hoạt Phương pháp hóa mô miễn dịch 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ sau khi cho chuột uống 3-MCPD (10 mg/kg, 50 mg/kg và 100 mg/kg), chuột được gây mê bằng thiopental (100 mg/kg, ip). Khi chuột đã mê, mở lồng ngực, dùng kim truyền ghim vào thất trái, cắt một vết nhỏ ở tĩnh mạch chủ phải và truyền dung dịch NaCl 0,9% để rữa sạch máu trong hệ tuần hoàn (cho đến khi gan chuyển thành màu vàng nhạt); sau đó truyền dung dịch paraformaldehyd (PFA) 4% để cố định mô. Tách lấy não chuột và ngâm trong dung dịch PFA qua đêm. Sau đó tiếp tục ngâm não chuột trong dung dịch sucrose 30% đến khi não chìm xuống (khoảng 2 ngày). Cắt não bằng máy cắt mô lạnh, độ dày lát cắt 25µm. Nhuộm hóa mô miễn dịch với kháng thể kháng c-fos theo qui trình sau: Rửa các lát cắt 3 lần với dung dịch đệm PBS 0,1M, pH=7,4. Ngâm lát cắt 20 phút trong dung dịch hydrogen peroxide 0,3%. Rửa 3 lần với dung dịch đệm PBS 0,1M, pH=7,4. Ủ các lát cắt 20 phút trong dung dịch albumin bò 5%. Ủ các lát cắt với dung dịch kháng thể sơ cấp qua đêm ở nhiệt độ 40C. Rửa 3 lần với dung dịch đệm PBS 0,1M. Ủ các lát cắt với dung dịch kháng thể thứ cấp khoảng 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Rửa 3 lần với dung dịch đệm PBS 0,1M. Ủ các lát cắt với dung dịch extravidin- peroxidase (30 phút ở nhiệt độ phòng). Rửa 3 lần với dung dịch đệm PBS 0,1M. Ngâm lát cắt 10 phút với dung dịch thuốc thử AEC (3-Amino-9-Ethyl-Carbazole) cho đến khi dung dịch có màu tím-hồng đến nâu. Đặt các lát cắt trên lam kính đã được phủ gelatin. Quan sát mẫu bằng kính hiển dưới vật kính 4, 10 hay 40. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 320 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Khảo sát sự biểu hiện c-fos sau khi cho chuột uống 3-MCPD liều 10 mg/kg ở các thời điểm 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn vùng võ não giữa và quan sát các mẫu mô cắt từ vị trí cách điểm Bregma trong khoảng từ 0.0 đến -1.0 mm. Khi quan sát sự nhuộm màu bằng hóa mô miễn dịch của các lát cắt não trong khoảng từ Bregma 0.0 đến -1.0, chúng tôi nhận thấy 3- MCPD liều 10 mg/kg hầu như không gây kích hoạt sự biểu hiện c-fos ở 3 thời điểm khảo sát. Mặc dù chúng tôi chỉ trình bày ở đây một số mẫu mô cắt điển hình, nhưng trên thực tế chúng tôi quan sát trên rất nhiều lắt mô cắt, và vùng quan sát rộng hơn rất nhiều (khoảng 100 lát cắt/não) (Hình 1). *Hình chụp ở vật kính 4 Hình 1. Sự biểu hiện c-fos ở các thời điểm khác nhau sau khi sử dụng 3-MCPD 10 mg/kg Khảo sát sự biểu hiện c-fos sau khi cho chuột uống 3-MCPD liều 50 mg/kg ở các thời điểm 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ Tương tự, ở liều 50 mg/kg, 3-MCPD cũng không gây biểu hiện c-fos trên các vùng não đã được quan sát (Hình 2). *Hình chụp ở vật kính 4 Hình 2. Sự biểu hiện c-fos ở các thời điểm khác nhau sau khi sử dụng 3-MCPD 50 mg/kg Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 321 Khảo sát sự biểu hiện c-fos sau khi cho chuột uống 3-MCPD liều 100 mg/kg ở các thời điểm 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ Sau 24 giờ Trong thí nghiệm này, 3-MCPD được sử dụng với liều rất cao 100 mg/kg. Tuy nhiên sau khi cho chuột uống 3-MCPD 24 giờ, chúng tôi không phát hiện có dấu hiệu biểu hiện c-fos. Sau 48 giờ Ở thời điểm 24 giờ, 3-MCPD không gây biểu hiện c-fos nhưng ở thời điểm 48 giờ chúng tôi quan sát được sự biểu hiện c-fos chủ yếu ở vùng vỏ não. Sự biểu hiện c-fos không tập trung trên một vị trí mà được trải ra một cách rải rác. Những vùng khác ngoài vỏ não hầu như không có sự biểu hiện của c-fos (Hình 3). Hình 3. Sự biểu hiện c-fos ở thời điểm 48 giờ sau khi sử dụng 3-MCPD liều 100 mg/kg Sau 72 giờ Tương tự, ở thời điểm 72 giờ, 3-MCPD cũng gây biểu hiện c-fos rải rác trong vùng vỏ não. Mặc dù không thể xác định chính xác được mức độ biểu hiện, tuy nhiên mật độ tín hiệu dương tính có vẻ thấp hơn so với thời điểm 48 giờ (Hình 4). Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Chuyên Đề Dược Khoa 322 Hình 4. Sự biểu hiện c-fos ở thời điểm 72 giờ sau khi sử dụng 3-MCPD liều 100 mg/kg Như vậy trên sự biểu hiện c-fos, 3-MCPD có các tác động sau: - Liều 10 mg/kg và 50 mg/kg: không gây biểu hiện c-fos ở các thời điểm quan sát là 24, 48, và 72 giờ - Liều 100 mg/kg: gây biểu hiện c-fos chủ yếu ở vỏ não, trong 2 thời điểm khảo sát là 48 giờ và 72 giờ. Ở thời điểm 24 giờ, không quan sát thấy có sự biểu hiện c-fos. BÀN LUẬN Trong phương pháp hóa mô miễn dịch, điều đặc biệt quan trọng giúp khẳng định kết quả thí nghiệm đạt mức chính xác cao là phải có các mẫu đối chứng dương và mẫu đối chứng âm. Tuy nhiên, mẫu chứng dương thường chỉ được cung cấp cho các mục đích xét nghiệm trên lâm sàng (các mẫu sinh thiết từ các mô bệnh đã được thẩm định). Trong nghiên cứu của chúng tôi, sự biểu hiện của c- fos chỉ căn cứ trên kết quả thí nghiệm thực tế (bắt màu hoặc không bắt màu) nên chúng tôi không thể loại trừ hoàn toàn khả năng xảy ra phản ứng chéo kém đặc hiệu khi sử dụng một kháng thể sơ cấp đa dòng. Tuy nhiên, nếu có xảy ra phản ứng chéo kém đặc hiệu thì kết quả này thường được quan sát thấy với tỷ lệ Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Khoa 323 cao hơn. Trong thí nghiệm của chúng tôi, sự biểu hiện của c-fos chỉ được ghi nhận ở liều 3- MCPD rất cao (100 mg/kg) và chỉ ở 2 thời điểm quan sát là 48 giờ và 72 giờ. Vì thế có thể xem đây là tác động của 3-MCPD trên tế bào thần kinh. Đối với mẫu chứng âm, chúng tôi đã sử dụng mẫu mô cắt với qui trình nhuộm không thay đổi nhưng sẽ không cho kháng thể sơ cấp kháng c-fos vào quá trình nhuộm. Vì thế có thể xem đây là một mẫu chứng âm có thể chấp nhận được và đây cũng là phương pháp được áp dụng rộng rãi trong các nghiên cứu sử dụng phương pháp hóa mô miễn dịch. Mặc dù chúng tôi không trình bày kết quả ở trong nghiên cứu này, nhưng chúng tôi luôn luôn tiến hành nhuộm mẫu chứng âm cho từng độ pha loãng của kháng thể. Trong nghiên cứu trước đây, chúng tôi cũng chứng minh được rằng 3-MCPD gây độc tính trên nhiễm sắc thể (đánh giá qua phương pháp vi nhân) và gây biến đổi hồng cầu thành dạng hồng cầu gai ở pha cấp tính (24-72 giờ) cũng chỉ ở liều 100 mg/kg. Trong nghiên cứu này, chúng tôi cũng ghi nhận được tác động gây biểu hiện c- fos của 3-MCPD cũng chỉ xảy ra ở liều 100 mg/kg. Đây là liều rất cao (so với liều LD50 trên chuột cống là 150 mg/kg), điều này cho thấy rằng tác động gây biểu hiện độc tính của 3- MCPD trong pha cấp chỉ xảy ra với liều cao, hầu như không xảy ra với các liều thấp hơn như 1 mg/kg, 20 mg/kg, 50 mg/kg mà chúng tôi đã nghiên cứu. Ở các liều thấp này, chúng tôi đã chứng minh được độc tính của 3-MCPD gây ra trên hồng cầu và tiểu cầu xảy ra sau 3-6 tháng uống 3-MCPD. Trong nghiên cứu này, chúng tôi chưa có điều kiện để nghiên cứu trong pha bán cấp tính và mạn tính. Hơn nữa, sự biểu hiện của c-fos thường chỉ ở giai đoạn sớm nên có thể nghiên cứu trong pha bán cấp tính và mạn tính sẽ gặp khó khăn. Chúng tôi chưa xác định được ý nghĩa bệnh lý của sự biểu biện của c-fos dưới tác động của 3-MCPD. Trong não bộ, c-fos được biểu hiện dưới tác động của nhiều tác nhân khác nhau như các chất dẫn truyền thần kinh, các yếu tố tăng trưởng và cả những độc tố. Sự tăng biểu hiện của c-fos có thể là do tăng hoạt tính dẫn truyền thần kinh, tăng quá trình sao chép ở nhân tế bào và cũng có thể là do quá trình tăng sinh tế bào. KẾT LUẬN Qua quá trình tiến hành thí nghiệm, chúng tôi đã thu được một số kết quả sau: -Đã sơ bộ thiết lập được qui trình hóa mô miễn dịch trong điều kiện phòng thí nghiệm và áp dụng để khảo sát sự biểu hiện của c-fos. -Đã khảo sát sự biểu hiện của c-fos trên vỏ não chuột nhắt sau khi cho chuột uống 3-MCPD ở 3 liều lượng 10 mg/kg, 50 mg/kg và 100 mg/kg ở 4 thời điểm: 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và 2 tuần. -Chỉ có 3-MCPD liều 100 mg/kg mới gây biểu hiện c-fos và sự biểu hiện này được quan sát rõ nhất ở thời điểm 48 giờ., ít hơn ở thời điểm 72 giờ, phù hợp với đặc tính của gen c-fos là chỉ biểu hiện thoáng qua và biến mất. -3-MCPD liều 10 mg/kg và 50 mg/kg không gây biểu hiện c-fos ở bất kỳ thời điểm nào đã khảo sát. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Cavanagh, J.B. & Nolan, C.C. (1993), “The neurotoxicity of alpha-chlorohydrin in rats and mice: II. Lesion topography and factors in selective vulnerability in acute energy deprivation syndrome”, Neuropathol. Appl. Neurbiol., 19, 471- 479. 2. Cavanagh, J.B., Nolan, C.C. & Sevile, M.P. (1993), “The neurotoxicity of alpha-chlorohydrin in rats and mice: I. Evolution of the cellular changes”, Neuropathol. Appl. Neurobiol., 19, 240-252. 3. Cho, W.S, Han, B.S., Lee, H. et al. (2008), “Subchronic toxicity study of 3-monochloropropane-1,2-diol administered by drinking water to B6C3F1 mice”, Food & Chem. Toxicol., 46, 1666-1673. 4. Collier PD, Cromiue DDO, & Davies AP (1991) Mechanisms of formation of chloropropanols present in protein hydrolysates. J. Am. Oil Chem. Soc., 68, 785–790. 5. Food Standards Agency (2001). Survey of 3- monochloropropane-1,2-diol (3-MCPD) in soy sauce and related products. No: 14/01, Food Standards Agency. 6. Tritscher, A.M. (2004), “Human health risk assessment of processing-related compounds in food”, Toxicol. Lett., 149 (1- 3), 177-186.